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电泳涂装理论技术知识

 
 1.电泳和电泳电泳是指溶液中带电粒子在电场中朝着带相反电荷的电极方向移动的现象。在生物科学中,电泳技术被广泛用于蛋白质,核酸和氨基酸的分离和鉴定。由于带电粒子的移动速度与场强密切相关,因此通常使用“迁移率”的概念来表示不同的材料具有不同的移动速度特性。电泳过程中带电粒子的迁移率是指粒子在单位电场强度下的移动速率(VX)。 2.影响迁移率的因素在电泳过程中,带电粒子的运动速率v与粒子的电荷Q和场强X,粒子半径r和介质的粘度η有关。 v=QX6πrη6π是球形电荷粒子的经验值,而对于椭圆或非常大的粒子则不同。带电粒子的运动速率与粒子本身的性质密切相关,并且粒子表面上的电荷量与材料的组成密切相关。另外,颗粒的尺寸(分子量)和颗粒的形状也具有重要的作用。因此,在一定的场强下,电泳过程中不同种类带电材料的运动速率不能完全一致,这种运动速率的差异是电泳技术的基本基础。 (1)样品中带电化合物的性质以多种方式影响其迁移率。 (1)电荷:流动性随净电荷的增加而增加。电荷的大小通常由pH值确定。
  (2)分子大小:分子越大,由于周围介质而产生的摩擦和静电力越大,这会降低迁移率。 (3)形状:大小相同但形状不同的分子,例如纤维蛋白和球形蛋白,由于摩擦作用的不同,具有不同的迁移特性。 (2)电场欧姆定律表示电流A(安培),电压V(伏特)和电阻(欧姆)之间的关系。 A=V /。因此,电场中的离子分离受到这三个因素的影响。
  (1)电流:在两个电极之间的溶液中,电流完全由缓冲液和样品中的离子传导,因此迁移率与电流成正比。离子传播距离与通电时间成正比。因此,为了获得最佳的可重复性,在电泳过程中电流必须保持恒定。当然,您需要使用直流电源。 (2)电压:电压控制电流,因此迁移率与施加到支撑介质上的电势差成正比。这是一个电压梯度,通常以电压/厘米(V/cm)表示(即,施加的电压除以支撑介质的长度)。低压(100-500 V)或高压(500-10,000 V)可以使用高达20和200 V/cm的电压梯度。高压是主要用于分离小分子的化合物。 (3)电阻:迁移率与电阻成反比,电阻由支撑介质的类型和大小以及缓冲液的离子强度决定。电阻随着支持介质的长度而增加,并且随着支持介质的宽度和缓冲离子强度的增加而减小。电泳期间,热量以A2瓦特的速率产生,并且随着温度的升高,电阻降低。因此,如果电压保持不变,则温度的升高将增加电流并促进溶剂在载体介质上的蒸发。为了获得尽可能多的可重复结果,使用了稳定的电源,并且由于温度波动不可避免地会发生电阻变化,但是这些电源可以自动保持恒定的电压或电流。用密闭的盖子盖住电泳槽,以减少蒸发。
  电泳槽上装有冷却系统,可在高压操作期间提供额外的冷却。 (3)缓冲液缓冲液以多种方式确定和稳定支持介质的pH值,并影响化合物的迁移率。 (1)成分:常用的缓冲剂有甲酸盐,乙酸盐,柠檬酸盐,巴比妥酸盐和磷酸盐,tris,EDTA和吡啶。硼酸缓冲液通常用于分离碳水化合物,因为它们会与碳水化合物形成带电荷的复合物。由于缓冲液是样品的溶剂,因此不可避免的是样品会扩散到一定强度。特别令人感兴趣的是小分子,例如氨基酸和糖。样品被转移到窄条上,以避免过多的负载。在尽可能短的时间内使用高电压。分离完成后,迅速取出并干燥以减少适当的散布。 (2)浓度:随着缓冲液的离子强度的增加,缓冲液中包含的分电流也增加,并且样品中包含的电流减小,这降低了样品的迁移率。增加缓冲液的离子强度也会增加总电流,从而增加热量的产生。在低离子强度下,缓冲液携带的电流下降,而样品携带的电流增加,以加速样品移动。低离子强度的缓冲液可降低总电流,减少热量的产生,但扩散程度更大,这会大大降低分辨率。因此,选择离子强度时应同时考虑两者,一般离子强度范围在0.02至0.2之间。离子性强度=12 ∑ CZ 2,C是离子的摩尔浓度,Z是其携带的电荷。 (3)pH:完全离子化的化合物(如无机盐)对pH的影响很小。但是对于有机化合物,pH值决定了电离度。有机酸的离子化随着pH的增加而增加,而有机碱则相反,因此迁移率由pH决定。对于碱性和酸性(两性)氨基酸之类的化合物,可以同时使用两种作用。因此,两种性电介质的运动方向和迁移程度由pH确定,并且取决于分离,可以使用pH在1至11范围内的缓冲剂。两个容器中的缓冲液通常是相同的,并且用于饱和支持介质,但是在凝胶电泳中,缓冲液是支持介质的一部分,因此通常使用缓冲罐进行凝胶电泳。另一个缓冲区。这允许电泳获得良好的分辨率。 (4)支撑介质作为支撑介质,使用了相对惰性的材料,但是介质的确切结构对化合物的迁移率有很大的影响,选择的介质取决于所用样品的类型。 (1)吸附:与吸附色谱法一样,这是支持介质在样品分子中的保留。这导致样品的尾部像彗星一样移动,并且没有形成清晰的条带,导致分离分辨率差。吸附还降低了整体流动性。纸张吸附最大,但使用醋酸纤维素实际上消除了这种影响。
  (2)电渗(电渗):这种现象是由缓冲液中水分子与支持介质表面之间产生的相关电荷引起的。氢化质子(H 3 O +)通常在载体介质中,由于离子化,并且通过一个水分子产生的缓冲组的离子的表面吸收。因为这些离子变成正电荷。因此,它与溶解的中性材料一起移动到阴极,从而加速了阳离子的进程并延迟了阴离子的移动。该作用通常可以忽略不计,但是一旦确定了化合物的等电点,就必须考虑该作用,并且迁移程度通常由中性分子(如尿素或葡萄糖)的电泳来确定。决定醋酸纤维素或聚丙烯酰胺凝胶的电渗作用不如纸或淀粉粘合剂明显。 (3)分子筛:这是凝胶电泳的特性。在这种电泳中,半刚性支持介质(凝胶)的分子性质有助于电泳迁移率和不同大小和形状的大离子化合物的分离。凝胶由分布在整个凝胶中的自由缠绕的分子链组成,使凝胶成为筛状结构。凝胶的孔径可以在一定范围内变化以适合特定的测定。琼脂,淀粉和聚丙烯酰胺凝胶分子筛的原理是,随着凝胶中交联度的增加,大分子的迁移率增加,孔径减小,电阻逐渐增大。
  如果使用Sephadex型凝胶,则相反,因为与大分子相比,其特性对小分子迁移的干扰较小。(2)纸上电泳和醋酸纤维素膜电泳
  纸电泳和醋酸纤维素膜电泳是一种使用滤纸或醋酸纤维素膜作为载体的电泳技术。
  纸电泳是一种在1940年代通过纸色谱开发的分离分析技术。简便,快速和出色的分离使其成为1950年代非常普遍的实验室方法。在此基础上,已经开发出了几种使用固相支持膜的类似分离方法,而醋酸纤维素膜电泳是以前开发的常用技术之一。纸电泳所需的设备很简单。其中一个带有稳压直流电源和一个简单的电泳槽。电泳槽通常由塑料制成,例如玻璃或有机玻璃,并且目前使用卧式电泳槽。内部有两个单独的缓冲罐,每个缓冲罐都有铂金丝或其他材料的电极。在两个缓冲罐中间的顶部,有一个用于放置(压平)滤纸的支架,滤纸的两端分别浸入两个罐的缓冲中。为了减少液体的蒸发,在电泳的顶部有一个盖,有时有一个适合减少电泳对生热影响的冷却装置。卧式电泳槽不仅适用于纸上电泳,还适用于醋酸纤维素薄膜和其他类型的膜电泳,也可以使用平板凝胶电泳,例如琼脂凝胶或淀粉凝胶。
  图1-2滤纸或醋酸纤维素膜电泳的电泳槽纸和醋酸纤维素膜电泳的缓冲液有几种类型,巴比妥缓冲液用于蛋白质电泳。例如,血清蛋白电泳通常在pH 8.6的Bobby de buffer中使用,浓度可在0.05到0.1M之间选择。缓冲液的浓度越高,电泳过程中滤纸上的缓冲液就不会受到盐电解的影响,但是由于离子强度高,电泳时间越慢。相反,较低的浓度缓冲能力较弱,电泳过程中pH值的影响会影响电泳效果,但离子强度较低,电泳速度较快,电泳时间较短且这是合适的。快速识别。纸和醋酸纤维素膜电泳的基本电泳过程包括以下步骤: 1.准备将适当的缓冲液倒入电泳槽中,并用铅笔过滤滤纸或醋酸纤维素薄膜(用缓冲液弄湿)。在距一端一定距离处标记一条起始线,并将其放在支架上,以使滤纸两端的滤纸桥或醋酸纤维素膜浸入缓冲液中。将两个电极都连接到电源(如果血清蛋白被pH 8.6缓冲液分开,则起始线应连接到阴极)。 2,使用点样器或毛细管将样品指向点样开始线。通常,每个样品的样品宽度约为1至2 cm,上样量约为10微升(取决于样品浓度)。
  3,打开电源,盖上电源开关,将电压(或电流)调节到所需值。通常,电压可以从1到10伏/厘米选择,电流可以从0.2到2毫安/厘米(宽度)选择。对于纸电泳,必须选择较低的电压(或电流),对于醋酸纤维素膜电泳,可以选择较高的电压或电流,因此纸张的电泳时间相应更长,因此醋酸纤维素膜电泳为与.相同那更短。后者的电渗和吸附能力小,分离效果好,可以使用较短的电泳距离(即,较短的电泳膜条),从而可以将电泳时间缩短至0.5至1小时。 4.纸的染色电泳染色前,必须将滤纸条加热并干燥,可以直接对醋酸纤维素膜进行染色而无需预先干燥。应根据实验材料和实验目的选择多种染料。例如,对于诸如溴酚蓝,酰胺黑10B,考马斯亮蓝和常用的染料Von Seu S之类的蛋白质,后者对乙酸纤维素的敏感性更高。显影剂常用于薄膜电泳。染色后,通常用合适的漂洗液(例如5%的乙酸)漂洗它们,并将漂洗液更换几次,直到背景漂洗液干净为止。
  5.定量染色后,用剪刀将鸡蛋切成白色条,将空白(与几个条带的平均宽度相同)切为空白对照,然后将每片鸡蛋放入4ml 1.5%的溶液中。在NaOH溶液的试管中,将每根试管的色带的颜色轻轻摇动到溶液中,然后将空白对照管用作空白进行比色计算,并根据各管的光密度值计算各部分的蛋白质含量百分比。对于醋酸纤维素膜电泳,也可以将干膜条浸入新鲜制备的透明液体(比例为3:7的冰醋酸-无水乙醇混合溶液)中,并在10到20分钟后涂在玻璃板上。作为透明薄膜,可以通过光密度计直接读取每个色带的色深,并可以进一步计算各种蛋白质的百分比。脂蛋白,糖蛋白或核酸可使用适当的染色方法定量。
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